Quince años han pasado desde que Selene y su amante Michael, híbrido entre humano y licántropo, derrotaran al Vampiro Mayor Marcus en Underworld Evolution. En esos años la humanidad ha descubierto la existencia tanto del clan de los vampiros como del de los licántropos y se ha lanzado a una lucha encarnizada para erradicar ambas especies. Selene, capturada durante el genocidio, se despierta después de más de una década y se da cuenta de que se encuentra cautiva en un laboratorio herméticamente cerrado en Antigen, una poderosa corporación biotecnológica que se dedica a desarrollar la vacuna en contra de los virus que han creado a vampiros y licántropos.
Selene se siente destrozada cuando descubre que Michael está muerto, pero su dolor es eclipsado por el descubrimiento de que mientras se hallaba en estado de criogenización ha dado a luz a la hija de ambos, Eve (India Eisley). Mientras busca asilo para ella y su hija, Selene se encuentra con que el mundo en el que su raza se alzara orgullosa ya no existe y que su gente ha sido perseguida hasta el borde de la extinción y que los pocos supervivientes se ocultan bajo tierra.
Rechazada por los clanes que aún quedan, Selene se enlista para apoyar a un joven vampiro, David (Theo James), quien se une a ella en su sangrienta venganza contra Antigen, donde oscuras fuerzas conspiran para destruirla tanto a ella como a su hija. Con sus tradicionales enemigos, los licántropos, otra vez en ascenso, incluso Selene parece no tener el poder suficiente para hacer frente a su más poderoso oponente en toda la historia de Underworld: un super licántropo alterado genéticamente.
